ECL化學發光底物（超敏）

產品簡介：

ECL超敏發光液用于檢測直接或間接標記辣根過氧化物酶HRP的抗體及其關聯的抗原。

產品組份：

用途：用于HRP標記抗體的Western Blot和HRP標記探針的核酸雜交。

產品特點：

1）可使用的抗體稀釋倍數(1:2000～1:10000)，極其節省抗體。

2）簡單易用— 可替代其它公司的ECL發光底物，操作步驟無需進行特別優化

3）靈敏度高— 可檢測低皮克級的蛋白

4）信號持續時間長— 光信號持續時間長達5小時

5）成像方法— 適用于X射線膠片、CCD或激光成像儀

使用方法:

1. 執行常規SDS-PAGE、轉膜和Western Blot步驟。注意用HRP標記lgG或用一抗-鏈親和素-生物素-HRP夾法。

操作概述

  注：優化抗原和抗體的濃度。必須使用建議的抗體稀釋度，以保證陽性結果。

1) 將一抗濃度稀釋到0.05～1ug/ml

2) 將二抗濃度稀釋到0.005～0.04ug/mL

3) 將兩種底物組份按1:1比例混合，制備底物工作液。

注：曝露于日光或任何其他強光可能損害工作液，為獲得最佳結果，將此工作液保存在琥珀色瓶中，并避免長期曝露于任何強光。短時間曝露于實驗室常規照明不會損害該工作液。

4) 將印跡膜在ECL底物工作液中孵育5分鐘。

5) 吸出多余試劑。用清潔的塑料膜蓋住該印跡膜。

6) 使印跡膜在X光膠片上曝光。

2. Western Blot最后一次洗膜的同時新鮮配制發光工作液：分別取等體積的溶液A和B，放入干凈容器中混合。建議立即使用工作液，室溫放置數小時后仍可使用但靈敏度略有降低。

3. 用鑷子取出膜，搭在濾紙上瀝干洗液但勿使膜完全干燥。將膜完全浸入發光工作液（0.125mL發光工作液/cm2膜）中，與發光工作液充分接觸。室溫孵育3分鐘，準備立即壓片曝光。孵育時間過長不會增加靈敏度，有時還會導致曝光條帶異常。發光過程的本質是酶促反應，使用過少的發光工作液不利反應進行，也會導致膜上條帶曝光不均和明顯降低靈敏度。為達節約目的可將膜剪小但勿降低發光液用量。

4. 用鑷子夾起膜，搭在濾紙上瀝干發光工作液。但勿洗去發光液。

5. 打開X光膠片暗盒，在暗盒內表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將Western Blot膜貼在保鮮膜上，將保鮮膜折起來完全包裹Western Blot膜，去除氣泡和皺褶，可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發光工作液。用膠帶將覆蓋Western Blot膜的保鮮膜固定在暗盒內，蛋白帶面向上。

6. 暗房內壓X光膠片，分別曝光不同的時間如數秒到數分鐘。顯影沖洗。           

注意事項：

（1）步驟1～5可在日光燈下操作；但發光液曝露于強光下時間過久靈敏度可能略有降低，移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。

（2）長時間曝光或蛋白過量，將加深背景并使條帶強弱變化失去線性關系。曝光不足則條帶模糊。

（3）發光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發光。強條帶發光在暗房中肉眼可見，低豐度蛋白條帶發光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發光時間。肉眼不可見的熒光實際上可持續數小時并使X光膠片感光，因而弱帶可曝光1-10小時。如果曝光后條帶不佳，可用洗膜緩沖液洗膜，重新孵育二抗，然后重新用ECL發光和曝光。

（4）由于超敏發光液極其靈敏，強烈推薦大多數進口抗體起始濃度為一抗1:1000～1:4000，二抗1:2000～1:5000?？贵w濃度過高將造成高背景或沒有條帶，導致失敗。

（5）某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光，應選擇高質量保鮮膜。

（6）使用肉眼可見的預染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標簽可精確確定膠片上條帶的位置和大小。

（7）NaN3能抑制HRP活性，回收第二抗體應避免使用NaN3，如必需使用勿超過0.01%。

問題解答：

*為檢測系統活性，在暗室中，在一個清潔試管中制備1-2ml工作液。關閉燈，添加1ul未稀釋的HRP標記二抗工作液。該溶液應當立即發出藍色光，藍光信號在隨后的幾分鐘漸淡。

保存條件：

室溫運輸，4 ℃密封避光保存一年以上，短期可放置室溫。