ECL化學發光底物（特超敏）

產品簡介：

ECL化學發光底物（特超敏）底物可為使用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯物的免疫印跡實驗提供明亮的信號和低皮克級檢測靈敏度。該ECL底物能夠兼容各種膜、封閉液和寬范圍抗體稀釋液，以出色性能、通用性和高性價比，滿足用戶的免疫印跡應用需求。

產品組份：

用途：用于HRP標記抗體的Western Blot和HRP標記探針的核酸雜交。

產品特點：

1、ECL：用于辣根過氧化物酶(HRP)的增強型化學發光底物;

2、低皮克級靈敏度：檢測硝化纖維素膜或PVDF膜上低皮克級的蛋白條帶;

3、長信號持續時間：在條件優化情況下，經底物孵育的印跡條帶能夠持續輸出6至8小時的可檢測光信號;

4、穩定試劑：工作液在24小時內保持穩定。

5、成像方法— 適用于X射線膠片、CCD或激光成像儀

6、價格經濟— 針對稀釋的抗體濃度條件進行了優化：

0.2至 1.0 μg/mL一抗（以1 μg/mL儲存液稀釋1:1,000至1:5,000倍）

10至 50 ng/mL二抗（以1 μg/mL儲存液稀釋1:20,000至1:100,000倍）

重要提示：

為獲得最佳效果，必須優化該系統的全部組分，包括樣品量、一抗和二抗濃度以及膜和封閉試劑的類型。

?   使用該產品比使用沉淀比色 HRP 底物檢測所需的抗體濃度低。為優化抗體濃度，請進行一次系統的點印跡分析。

?   沒有一種封閉試劑對所有系統而言都是最佳的，所以為每一個免疫印跡檢測系統找到最合適的封閉緩沖液非常必需。封閉試劑有可能與抗體產生交叉反應，導致出現非特異性信號。封閉緩沖液同時也會影響系統的靈敏性。當從一種底物轉換為另一種底物時，有時會出現信號衰減或背景增加的現象，原因可能是封閉緩沖液不適合新的檢測系統。

?   使用親和素/生物素檢測系統時，避免使用牛奶作為封閉試劑，因為牛奶中含有不定量的內源性生物素，會導致高背景信號。

?   保證洗滌緩沖液、封閉緩沖液、抗體溶液和底物工作液的使用體積，以確保在整個實驗過程中印跡膜完全被液體覆蓋，避免膜變干。增大封閉緩沖液及洗滌緩沖液的使用量可以降低非特異性的信號。

?   為獲得最佳效果，在孵育步驟請使用搖床。

?   將 Tween20(終濃度 0.05-0.1%)加入封閉緩沖液和稀釋的抗體溶液，以降低非特異信號。使用高品質的產品，如去污劑。它保存在安瓿中，過氧化物和其他雜質含量很低。

?   不要使用疊氮鈉作為緩沖液的防腐劑。疊氮鈉是 HRP 的抑制物

?   避免手與膜直接接觸，實驗過程應戴手套或使用干凈的鑷子

?   所有設備必須清潔且不沾染外來物質。金屬器械（如剪刀）不得具有可見的銹跡。銹跡可能導致斑點形成和高背景。

?   底物工作液在室溫下可穩定 8 小時。日光或任何其他強光下可能損害底物，為獲得最佳結果，將底物工作液保存在琥珀色瓶中，并避免長期暴漏在任何強光下，短時間暴漏于實驗室常規照明不會損害該工作液。

使用方法:

操作概述

注：優化抗原和抗體的濃度。必須使用建議的抗體稀釋度，以保證陽性結果。

有關建議的稀釋度范圍請參考其他所需材料。

1) 將一抗濃度稀釋到 0.2～1ug/ml

2) 將二抗濃度稀釋到 10～50ng/mL

3) 將兩種底物組份按 1:1 比例混合，制備底物工作液。

注：曝露于日光或任何其他強光可能損害工作液，為獲得最佳結果，將此工作液保存在琥珀色瓶中，并避免長期曝露于任何強光。短時間曝露于實驗室常規照明不會損害該工作液。

4) 將印跡膜在 ECL 底物工作液中孵育 5 分鐘。

5) 吸出多余試劑。用清潔的塑料膜蓋住該印跡膜。

6) 使印跡膜在 X 光膠片上曝光。

其他所需材料

A．已完成轉印的印跡膜：用合適的電泳法分離蛋白質，并將這些蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。

B.稀釋緩沖液：使用 Tris 或磷酸鹽緩沖液。

C.洗滌緩沖液：將 5mL 10%的 Tween-20 加入 1000mL 稀釋緩沖液（Tween-20 的終濃度將 0.05%）。

D.封閉試劑：將 0.5mL10%的 Tween-20 加入 100mL 的封閉緩沖液，選擇一種與稀釋緩沖液具有相同基本組分的封閉緩沖液。

E.一抗： 選擇一種目標蛋白質特異性抗體。使用稀釋緩沖液制備該抗體的 1ug/ml 儲備液。使用封閉試劑將抗體從儲備液稀釋成抗體工作液。 稀釋度介于 1:1000 和 1:5000 之間或抗體工作液濃度為0.2～1ug/ml.最佳稀釋度取決于一抗和膜上的抗原量。

F.HRP 標記的二抗：選擇一種與二抗特異性結合的 HRP 標記二抗，使用稀釋緩沖液制備該抗體的1ug/ml 儲備液。使用封閉試劑將抗體從儲備液稀釋成抗體工作液。稀釋度介于 1:20000 和1:100000 之間或抗體工作液濃度為 10～50ng/ml。該濃度范圍在使用鏈親和素-HRP 時也適用。二抗的最佳稀釋度取決于 HRP 標記二抗和膜上的抗原量。

G.用于處理放射顯影膠片的膠片暗盒、顯影和定影試劑

H. 用于孵育的旋轉搖床。

蛋白印跡法詳細操作步驟

1) 將印記膜從蛋白轉印設備中取出，加入合適的封閉液在溫室下孵育 20-60 分鐘，同時振蕩。以封閉膜上非特異性蛋白結合位點。

請注意：使用在前文建議的抗體稀釋度是非常重要的。

2) 將膜從封閉液中取出，與一抗工作液在溫室孵育 1 小時，同時振蕩；或在 28℃孵育過夜，不振蕩。

3) 將足量的洗滌緩沖液加至膜上，保證緩沖液將膜完全覆蓋。振蕩孵育≥5 分鐘，更換洗滌緩沖液并重復該步驟 4-6 次。增加洗滌緩沖液體積，洗滌次數和洗滌時間有助于降低背景信號。

注：孵育前，膜在洗滌緩沖液中的短暫淋洗會提高洗滌效率。

請注意：使用在前文建議的 HRP 標記二抗稀釋度是非常重要的。

4) 將 HRP 標記的二抗工作液與膜在溫室孵育 1 小時，同時振蕩。

5) 重復步驟 3，以除去未結合的 HRP 標記二抗。 注：膜與 HRP 標記二抗孵育后必須進行徹底洗滌。

6) 將 A 溶液與 B 液等比例混合，制備成工作液。每 cm2 膜使用 0.01～0.1ml 工作液。工作液可以在溫室下穩定 8 小時。

注：曝露于日光或任何其他強光下可能損害工作液，為獲得準確結果，將此工作液保存在琥珀色瓶中，并避免長期曝露于任何強光。實驗室的常見照明不會損害工作液。

7) 將印記膜在工作液中孵育 5 分鐘。

8) 從工作液中取出印記膜，并置于一個塑料片或清潔的塑料紙（膜）中，用一張吸水紙吸除多余的液體，并從印記和塑料紙之間小心地壓出氣泡。

9) 將包在塑料紙（膜）中的印記膜置于膠片暗盒中，蛋白質面朝上，除適用于膠片曝光的燈（如紅色安全燈）之外，關閉所有的燈。

注;膠片必須在曝光期間保持干燥，為獲得最佳效果，才去一下措施：

* 確保將多余的底物從膜和塑料紙上完全去除。

* 在整個膠片處理期間，使用手套。

* 切莫將印記膜置于已顯影的膠片上，因為膠片上的化學物質會減弱信號。

10) 將 X 光膠片置于膜的上面。建議第一次曝光 60 秒。之后可調整曝光時間以達到最佳結果?；瘜W發光反應在底物孵育后的前 5-30 分鐘期間是最強烈的。這一反應可以持續幾個小時，但強度會隨時間下降，如有底物孵育后較長時間后曝光，曝光時間可能需要延長以獲得較強信號。如果使用磷光存儲成像設備（如 Bio-Rad 的分子成像儀系統）或 CCD 照相機可能需要較長的曝光時間。

警告：膠片與膜之間的任何移動可能在膠片上造成人為的非特異信號。

11) 使用合適的顯影劑和定影劑對膠片進行顯影。如果信號太強，則縮短曝光時間或將印記膜進行剝離并降低抗體濃度重新檢測。

問題解答：

*為檢測系統活性，在暗室中，在一個清潔試管中制備1-2ml工作液。關閉燈，添加1ul未稀釋的HRP標記二抗工作液。該溶液應當立即發出藍色光，藍光信號在隨后的幾分鐘漸淡。

保存條件：

4 oC密封避光保存一年以上，短期可放置室溫。